BI 滅菌時(shí)間需要多久呢?

影響生物指示劑 (BI) 滅菌時(shí)間的主要變因?yàn)殒咦訑?shù) (Population) 和D-Value (使菌數(shù)下降90% / 1 log 所需的滅菌時(shí)間)，MesaLabs 生物指示劑的 COA 上會(huì)列出 Population、Z-Value (使 D-value 改變10倍 / 1 log 所需的溫度差)、在一個(gè)或多個(gè)滅菌溫度下以專用滅菌器 (Biological Indicator Evaluator Resistomer, BIER) 所測(cè)得的 D-Value 和 Survival / Kill Time 等等數(shù)據(jù)，提供用戶端作為滅菌設(shè)備參數(shù)的依據(jù)，而當(dāng)用戶端的滅菌溫度未列在 COA 上時(shí)，我們可以用 COA 上的 Population、D-Value 和 Z-Value 計(jì)算出該條件下的滅菌時(shí)間 (Kill time)，接下來(lái)會(huì)以 EZS/6 的 COA 為例說明與計(jì)算 (圖一)：



一、計(jì)算 COA 上的 ⁽²⁾Survival / Kill Time
依據(jù) ISO 11138 和 USP 定義的算式
Survival time/dose = not less than the D-value x (Log₁₀ labeled viable test organism count per carrier – 2)
範(fàn)例：1.7 minutes x (log₁₀ 2.6 X 10⁶ - log₁₀ 10²) = 7.51 minutes

Kill time/dose = not more than the D-value x (log₁₀ labeled viable test organism count per carrier + 4)
範(fàn)例：1.7 minutes x (log₁₀ 2.6 X 10⁶ + log₁₀ 10⁴) = 17.71 minutes
代表孢子對(duì)數(shù)減少 Spore Log Reduction (SLR) 數(shù)量為 BI 孢子皆被殺滅後，存活孢子數(shù)不到0.001個(gè)。

二、計(jì)算理論殺滅時(shí)間
Theoretical kill time = (Log₁₀ N0 + 1) x D-value
範(fàn)例：1.7 minutes x (Log₁₀ 2.6 x 10⁶ + Log₁₀ 10⁰) = 12.6 minutes
代表 SLR 數(shù)量為 BI 孢子數(shù)皆被殺滅後，存活孢子數(shù)不到1個(gè)。
結(jié)論：綜合法規(guī)算式和理論算式以及 BIER 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，孢子殺滅時(shí)間為12.6 ~ 17.71分鐘 (圖二)。



三、計(jì)算未在 COA 上列出的溫度下孢子的理論殺滅時(shí)間
依據(jù) ISO 11138 的算式，計(jì)算131 ºC 的 D-Value 和 Kill Time
D₁ = D2× 10^{(T2 - T1)/Z}
範(fàn)例：D₁₃₁ = 1.7 × 10^{(121 - 131)/15.2} = 0.4 minutes

D₁ is the D-value at temperature T1 (e.g. the D₁₃₁-value)
D₂ is the known D-value at temperature T₂ (e.g. D₁₂₁-value = 1.7 minutes)
Z is the Z-value (e.g. 15.2ºC)

Theoretical kill time = (Log₁₀ N₀ + 1) x D-value
範(fàn)例：0.4 minutes x (Log₁₀ 2.6 x 10⁶ + Log₁₀ 10⁰) = 3.0 minutes

滅菌時(shí)間除了可以參考 COA 上列出的 Kill Time，也可以用 Population、D-value 和 Z-Value 計(jì)算出符合用戶端需求 (例如時(shí)間效率或用戶所遵循的法規(guī)) 的滅菌時(shí)間。

介紹
生物製劑 (Biologics) 的製造是一個(gè)複雜且花費(fèi)甚高的過程，通過該過程可以回收並純化蛋白質(zhì)，去除污染物，以生產(chǎn)最終藥物產(chǎn)品。這是通過一系列過濾和層析過程完成的。實(shí)現(xiàn)和保持所需的產(chǎn)品質(zhì)量和純度需要優(yōu)化製程參數(shù)以及精確控制這些參數(shù)。
 
在整個(gè)下游製程中，測(cè)試和釋放緩衝液的傳統(tǒng)測(cè)量包括pH值和電導(dǎo)率。目前，通過程序控制 (例如標(biāo)準(zhǔn)操作程序 SOP) 以及通過結(jié)合 pH 值的間接測(cè)量來(lái)確保緩衝液成分濃度和電導(dǎo)率。pH值和電導(dǎo)率都是相互關(guān)聯(lián)的，具有分子特異性，並且取決於條件下分子的解離程度。
 
滲透壓在本研究中被評(píng)估為正交測(cè)量 (Orthogonal Measurement)，具有增加一致性和改進(jìn)生物製程控制策略的潛力。滲透壓是每千克水中溶質(zhì)摩爾數(shù)的量度，因此相對(duì)不受分子類型、電離度或pH值的影響。進(jìn)行這項(xiàng)研究是為了了解滲透壓如何進(jìn)行濃度測(cè)量，以及它如何與 pH 值和電導(dǎo)率的測(cè)量進(jìn)行比較。
 
材料與方法
本篇研究中使用 Advanced Instruments的OsmoTECH^® 單樣品微滲透壓計(jì)測(cè)量滲透壓，該滲透壓計(jì)採(cǎi)用冰點(diǎn)降低法(Freezing point depression method)。
 
結(jié)果
下面的七組圖顯示了每組溶液三個(gè)屬性的平均值和 %CV (標(biāo)示error bar)。Error bar 表示極小 CV 不可見。每組圖表的軸都進(jìn)行了調(diào)整以突出趨勢(shì)。
(詳細(xì)數(shù)據(jù)請(qǐng)見完整文章)
 

圖1. 檸檬酸鹽緩衝液濃度曲線上滲透壓和 pH 值的比較。 y 軸擴(kuò)展了整個(gè) pH 範(fàn)圍，以突出顯示檸檬酸鹽緩衝液濃度之間相對(duì)較小的變化。滲透壓計(jì)的靈敏度遠(yuǎn)高於 pH 探針，如 pH 濃度曲線的低斜率所示。


圖2. 乙酸(弱離子溶液)的電導(dǎo)率在濃度為1 M 時(shí)急劇下降，並隨著濃度的增加而保持恆定。
 
討論
數(shù)據(jù)顯示，pH 值和電導(dǎo)率不能提供 Tris、乙酸、檸檬酸和檸檬酸鹽等緩衝液濃度的最佳測(cè)量值範(fàn)圍。另一方面，滲透壓為上述緩衝液提供了成比例的廣泛測(cè)量值範(fàn)圍。雖然電導(dǎo)率和 pH 值在下游生物製程中具有明確的價(jià)值，但滲透壓可以提供有關(guān)緩衝液濃度的更多信息。測(cè)量 pH 值在下游生物製程中至關(guān)重要；然而，它缺乏靈敏度，因?yàn)楣?fàn)圍在緩衝液濃度範(fàn)圍內(nèi)變化很小。
 
例如，檸檬酸鹽緩衝液(圖1)的 pH 的測(cè)量範(fàn)圍為0.5，而滲透壓的測(cè)量曲線則約500 mOsm/kg H₂O。這是普遍趨勢(shì)，表明滲透壓提供了比單獨(dú)測(cè)量 pH 值更寬的動(dòng)態(tài)範(fàn)圍和更高的靈敏度。電導(dǎo)率通常在下游緩衝液和試劑中測(cè)量，因?yàn)樗峁┝穗x子溶液濃度的概念。它對(duì)非離子和弱離子溶液(如乙酸)不可靠。在1 M 濃度以上，乙酸的電導(dǎo)率保持在1 mS/cm 左右(圖2)，但這種影響並未反應(yīng)在滲透壓測(cè)量中。
 
本研究證明了滲透壓作為常見下游緩衝液濃度測(cè)量的敏感性。這些數(shù)據(jù)支持滲透壓作為電導(dǎo)率和 pH 值的一個(gè)有價(jià)值的正交特性。由於滲透壓的敏感性增加，這將是幫助檢測(cè)緩衝液濃度或配方潛在問題的理想方法。鑑於測(cè)量的簡(jiǎn)單性及其增加的價(jià)值，應(yīng)考慮在下游製程工作流程中進(jìn)行滲透壓測(cè)試，以提供更完整和全面的下游緩衝液製程數(shù)據(jù)。
 
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