2023/11/02 Exosome檢測(cè)對(duì)於醫(yī)藥領(lǐng)域的貢獻(xiàn)
細(xì)胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 是細(xì)胞釋放的各種帶有膜結(jié)構(gòu)的囊泡統(tǒng)稱。根據(jù)粒徑大小和形成方式的不同，它們可分為外泌體、微囊泡和細(xì)胞凋亡小體。在這三種細(xì)胞外囊泡中，外泌體 (Exosome) 的粒徑分佈最為均勻，成分最複雜，功能亦最多樣，因此它的研究?jī)r(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值很高，對(duì)其研究也相對(duì)廣泛和深入。
近年來，隨著外泌體研究的不斷深入，對(duì)其應(yīng)用的研究也變得更加豐富和多樣化。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究者發(fā)現(xiàn)外泌體與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，因此它們可能作為疾病診斷和預(yù)測(cè)的生物標(biāo)誌物。在藥學(xué)領(lǐng)域，外泌體因其特有的雙層膜結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，可用作造影劑或藥物的傳送載體。
鑒別外泌體的來源是多種且多樣的，因此有必要確定分離得到的成分是否確實(shí)為外泌體。鑒別外泌體的方法包括物理分析和化學(xué)分析兩類：
物理分析方法包括納米顆粒追蹤分析 (NTA)、動(dòng)態(tài)光散射 (DLS)、透射電子顯微鏡或掃描電子顯微鏡 (TEM/SEM) 以及可調(diào)電阻脈沖感測(cè)，主要以外泌體的粒徑分佈和形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。
化學(xué)分析法則包括流式細(xì)胞檢測(cè)方法，西方墨點(diǎn)法以及酵素免疫分析法，主要對(duì)外泌體的生物標(biāo)誌物進(jìn)行檢測(cè)。
國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) (ISEV) 在2014年提出，在檢測(cè)代表性外泌體時(shí)，會(huì)使用WB檢測(cè)生物標(biāo)誌物，NTA 檢測(cè)粒徑大小及透射電鏡檢測(cè)顆粒形態(tài)三種方法來互相印證。其中用 WB 方法檢測(cè)外泌體的過程中，應(yīng)遵循“三陽(yáng)一陰”的規(guī)則，即至少需要檢測(cè)三種陽(yáng)性蛋白質(zhì)標(biāo)記，包括至少一種跨膜/脂質(zhì)結(jié)合蛋白，一種細(xì)胞質(zhì)蛋白和至少一種陰性蛋白質(zhì)標(biāo)記。常見的外泌體生物標(biāo)誌物包括：CD63、CD81、CD9、HSP70、HSP90、TSG101、ALIX、Actin、Annexins 等。在2018年，MISEV 更新了對(duì)外泌體表徵的要求，在保留“三陽(yáng)一陰”的基礎(chǔ)上，豐富了需要進(jìn)行檢測(cè)的蛋白類型，並強(qiáng)調(diào)了陰性對(duì)照檢測(cè)和純度檢測(cè)的重要性。
對(duì)於實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)，Cytiva 的成像系統(tǒng)可以提供影像拍攝，幫助蛋白質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。一些應(yīng)用案例包含如下：
案例一：間質(zhì)幹細(xì)胞的外泌體特徵
研究者從骨髓間質(zhì)幹細(xì)胞中分離外泌體，透過透射電鏡觀察其形態(tài)，並透過 Western Blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)誌物 CD63、CD81 以及間質(zhì)幹細(xì)胞標(biāo)誌物 CD73。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明示，從透射電鏡觀察到大小不一的雙層囊泡 (圖1A)。根據(jù) Western Blot 結(jié)果，CD61，CD81，CD73 都有明顯的表現(xiàn) (圖1B)。
案例二：使用外泌體作為含碘顯影劑載體標(biāo)記腫瘤部位
含碘的顯影劑常用於 CT 檢查，但由於顯影劑無法標(biāo)記，檢測(cè)腫瘤的能力受限制。研究者使用外泌體作為含碘顯影劑的載體，通過 MISEV2018 要求的方法鑒定分離得到的外泌體，包括粒徑大小 (圖2A)、形態(tài) (圖2B) 和生物標(biāo)誌物 TSG101 (圖2C)。結(jié)果顯示，外泌體可以當(dāng)作含碘造影劑的有效載體。
案例三：從帕金森患者血漿中分離外泌體並檢定
除了使用 WB 等常規(guī)方法檢測(cè)外泌體，也有研究者使用斑點(diǎn)印跡法 (Dot Blot) 來分析帕金森患者血漿中的外泌體。研究者採(cǎi)集了帕金森病患者和對(duì)照組的血液樣本，經(jīng)過多步離心和沉澱試劑處理後，純化得到外泌體 (圖3A)。接下來，他們對(duì)血漿樣品和血漿來源的外泌體進(jìn)行生物標(biāo)誌物的 Dot Blot 分析。他們使用 CD63 作為一抗，接著使用螢光二抗，最後使用 Cytiva Typhoon 雷射掃描成像儀進(jìn)行成像 (圖3B)。使用總蛋白對(duì) CD63 訊號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行 Normalization，每個(gè)點(diǎn)代表一名帕金森病患者或?qū)φ照?(圖3C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較於血漿樣品，純化得到的外泌體中 CD63 含量更高。此外，研究者還使用透射電子顯微鏡 (圖3D) 和粒徑分佈測(cè)試 (圖3E) 對(duì)純化得到的外泌體進(jìn)行鑒定，結(jié)果皆說明了分離得到的組分符合外泌體的基本特徵。
高靈敏度的 Cytiva 的成像系統(tǒng)不僅在外泌體研究中頻頻亮相，也活躍在其他的蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域，是廣大科研工作者的好幫手。如果還在為選購(gòu)好用的成像系統(tǒng)而擔(dān)憂，不妨試試 Cytiva 成像系統(tǒng)，以提高實(shí)驗(yàn)成相結(jié)果的品質(zhì)。
參考資料:
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