你是否還在為血清凍融問題所困擾！
未用完的解凍血清是否可以繼續(xù)凍存使用??！
多次凍融是否影響細胞生長和血清品質(zhì)?。?！
HyClone 通過科學(xué)的實驗資料
來為你“排憂解難”


材料與方法
選取任一批次 HyClone Cosmic Calf™Serum (加強型小牛血清-貨號：SH30413)和 HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (澳洲優(yōu)級胎牛血清-貨號：SH30084)用於此研究。
(1) 每個批次選取 5 瓶並標記1×到5×
(2) 瓶1×保持凍存狀態(tài)，瓶2×至 5×常溫解凍。
(3) 在解凍過程中，每 20-30分鐘混合操作一次。
(4) 待完全解凍後，立即於-20℃ 下重新凍存至隔夜。
(5) 瓶 3×至瓶 5×分別再進行1次、2次、3次凍融。


生長研究
選取 5 種細胞株，測定各個血清的培養(yǎng)性能。表 1 中列出了細胞株及基礎(chǔ)培養(yǎng)基的類型。所有的培養(yǎng)基需添加 10% 的待測血清。針對貼壁細胞，以1.0×10⁴/cm² 的活細胞密度接種到 T25 培養(yǎng)瓶中(三個平行試驗)。當細胞融合率達到90%時，計數(shù)。若為懸浮細胞，以 8.0×10³/mL 的活細胞密度接種到 T25 培養(yǎng)瓶中，從第三天開始，每天計數(shù)一次，直到細胞活率下降(培養(yǎng)條件：37℃ 5%CO₂)。


生化分析
所有瓶裝血清樣品進行生化實驗測定，確定血清成分是否有明顯變化。


沉澱分析
比濁法測定樣品中的沉澱物，並通過肉眼檢測的方法判斷多次解凍/凍存是否會增加微粒物質(zhì)的數(shù)量。

表1. 細胞及培養(yǎng)基類型


結(jié)果與討論
? 圖1到圖5是細胞生長的結(jié)果，細胞密度沒有明顯的變化。
? 血清生化分析結(jié)果(可向岑祥詢問)，血清成分沒有明顯的變化。
? 濁度分析結(jié)果(表2)表明微粒物質(zhì)的數(shù)量沒有明顯的變化。所有結(jié)果都經(jīng)肉眼確認。



圖 1. MRC-5 細胞生長結(jié)果(DMEM +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))


圖 2. VERO 細胞生長結(jié)果(DMEM +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))


圖 3. CHO-K1 細胞生長結(jié)果(Ham’s F12 +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))


圖 4. FOX-NY 細胞生長結(jié)果(DMEM +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))


圖 5. Sp2/0-Ag14 細胞生長結(jié)果(DMEM +10% FBS(A) 或加強型小牛血清(B))


表 2. 血清濁度分析結(jié)果(多次解凍/凍存)


結(jié)論
經(jīng)過 5 次解凍/凍存迴圈的血清在細胞生長性能、生化分析資料和濁度方面沒有明顯的變化，我們認為血清經(jīng)多次解凍/凍存迴圈(可達5次)之後，不會影響細胞的生長。雖然測定資料顯示，經(jīng)過多達 5 次解凍/凍存血清性能並未出現(xiàn)明顯的下降，但反復(fù)凍融會造成血清的沉澱增多，給後續(xù)處理帶來麻煩，我們建議血清的解凍/凍存次數(shù)越少越好。

概述
在多種用於異源蛋白表達的系統(tǒng)和培養(yǎng)模式中，治療性抗體藥物的產(chǎn)業(yè)化製備始終以哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)製程為主。其中中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是用於治療性單克隆抗體生產(chǎn)的主要宿主，2016 年至今獲批上市的治療性抗體藥物全部為CHO細胞來源。但是在目前占主導(dǎo)地位的饋料批次培養(yǎng)製程中CHO細胞的新陳代謝遠未達到理想和最優(yōu)狀態(tài)，其培養(yǎng)製程的建立需要大量的專業(yè)知識以及製程優(yōu)化和過程監(jiān)控。培養(yǎng)過程中具有毒性和抑制生長的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累，是造成這種情況的主要原因之一。
 在這些代謝產(chǎn)物中以乳酸和氨最具代表性，本文將就 CHO 細胞饋料批次培養(yǎng)中乳酸代謝的情況進行簡單整理，包括培養(yǎng)過程中乳酸的生成和消耗，乳酸代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生的機制，影響和調(diào)控因素及其在製程開發(fā)中的應(yīng)用。

 (一)饋料批次培養(yǎng)中 CHO 細胞的生長及糖代謝特點
體外培養(yǎng) CHO 細胞的代謝通常以效率低下和次優(yōu)為特點，特徵是高效率吸收培養(yǎng)基中的葡萄糖和穀氨醯胺等底物作為碳源和氮源。
 作為主要碳源的葡萄糖被細胞吸收並磷酸化為 6 磷酸葡萄糖(G6P)，用於糖酵解生成三磷酸腺苷(ATP)，還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸。丙酮酸可以通過三羧酸迴圈徹底氧化為二氧化碳和水，釋放大量能量供細胞利用；也可以通過乳酸脫氫酶A(DHA)的作用與 NADH 的氧化一起轉(zhuǎn)化為乳酸。其中 35-70%的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)榇x廢物如乳酸，並對細胞培養(yǎng)性能發(fā)生不同程度的影響。
 CHO 細胞饋料批次培養(yǎng)中的生長通常可以分為三個主要階段，即以細胞密度大幅度增加為主的對數(shù)生長期，細胞密度趨於穩(wěn)定的穩(wěn)定期，以及細胞密度和活率持續(xù)下降的凋亡期。
 不同生長階段 CHO 細胞的代謝在很多方面會發(fā)生明顯變化，在這些代謝變化中乳酸從生成到消耗的轉(zhuǎn)移，是對饋料批次培養(yǎng)具有較大影響的是一個關(guān)鍵事件，與批次培養(yǎng)週期的延長、最終產(chǎn)物產(chǎn)量的提高等關(guān)係密切。
 
(二) CHO 細胞流饋料次培養(yǎng)中的乳酸代謝及其代謝轉(zhuǎn)移
乳酸是目前發(fā)現(xiàn)的 CHO 細胞培養(yǎng)中主要毒性代謝產(chǎn)物之一，可以引起培養(yǎng)環(huán)境的酸性變化，為了維持培養(yǎng)環(huán)境的酸堿恒定，需要通過補充鹼性物質(zhì)對 pH 進行調(diào)節(jié)，而堿劑的補充則會引起滲透壓升高，抑制細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡從而降低重組治療產(chǎn)品的生產(chǎn)率，某些情況下也會影響抗體產(chǎn)物的品質(zhì)。
 饋料批次培養(yǎng)中乳酸代謝通常會分為兩個不同階段:
對數(shù)期
在細胞快速生長的對數(shù)期，葡萄糖通過不完全氧化代謝滿足細胞快速增殖中對 ATP和脂肪酸的需求，葡萄糖的快速消耗伴隨著乳酸的大量產(chǎn)生。
穩(wěn)定期
隨著細胞由快速生長進入穩(wěn)定期，乳酸由生成轉(zhuǎn)變?yōu)橄?。乳酸從生成到消耗的代謝轉(zhuǎn)變，通?？梢宰鳛轲伭吓闻囵B(yǎng)製程中細胞代謝效率的標誌。
目標蛋白的高表達量與細胞培養(yǎng)中後期乳酸的代謝轉(zhuǎn)移呈強烈的正相關(guān)。缺乏有效的代謝轉(zhuǎn)移調(diào)控手段，是導(dǎo)致製程可變性增加的主要因素之一。加強對乳酸代謝的理解對於基於哺乳動物細胞培養(yǎng)的生物製程具有重要指導(dǎo)意義。當細胞快速增殖被突然打斷，糖酵解通量降低，及細胞外乳酸濃度升高等外部條件都可以觸發(fā)這種代謝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
 
(三) 乳酸代謝及其代謝轉(zhuǎn)移的影響及調(diào)節(jié)因素
饋料批次培養(yǎng)中細胞代謝的影響因素及調(diào)節(jié)策略很多，包括遺傳水準的影響及干預(yù)，細胞培養(yǎng)基組分的影響及調(diào)節(jié)，補料策略及培養(yǎng)環(huán)境的理化因素等。
 
01遺傳水準的干預(yù)
從遺傳水準對哺乳動物細胞培養(yǎng)中的乳酸代謝進行干預(yù)，是指基於細胞培養(yǎng)中的代謝通量研究和轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的結(jié)果，利用基因工程手段對代謝通路中的關(guān)鍵酶，進行基因水準的調(diào)整，製備出代謝特性改善的宿主細胞系。
通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝通量研究發(fā)現(xiàn)，代謝轉(zhuǎn)移時細胞能量代謝相關(guān)的酶下調(diào)，但是還不足以由此引起代謝轉(zhuǎn)移。細胞外的高乳酸濃度，可以抑制糖酵解途徑的關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶的活性，降低糖酵解代謝通量，促進乳酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化。在培養(yǎng)的後期，糖酵解活性調(diào)節(jié)的AKT1和P53信號通路的轉(zhuǎn)錄水準發(fā)生變化。
● 以往針對乳酸代謝調(diào)整的細胞工程化加工，重點集中在宿主細胞的固有基因的調(diào)節(jié)。
包括降低細胞乳酸脫氫酶的表達水準，促進丙酮酸進入線粒體；通過細胞轉(zhuǎn)運器調(diào)節(jié)細胞利用葡萄糖或葡萄糖替代物的能力；部分抑制乳酸脫氫酶A的基因，降低乳酸的產(chǎn)生以及葡萄糖的消耗，從而改善細胞生長；同時調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶和3-磷酸甘油脫氫酶活性，改善細胞生長和表達；增加丙酮酸脫氫酶激酶活性減少乳酸積累並增加抗體產(chǎn)量等等。
● 近年來開始嘗試在細胞中引入外源基因，對乳酸代謝特性進行調(diào)節(jié)。
例如重組酵母丙酮酸羧化酶(Recombinant yeast pyruvate carboxylase PYC2)。
研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達外源 PYC2 的 CHO 細胞來源的單抗表達克隆，在培養(yǎng)中傾向于向乳酸消耗的顯著和系統(tǒng)性代謝轉(zhuǎn)變，可有效延長細胞培養(yǎng)的對數(shù)生長期，提高細胞峰密度，進而增加抗體產(chǎn)物的表達量，見圖 1。
即使在高葡萄糖水平下，表達PYC2的CHO細胞克隆，在饋料批次培養(yǎng)中也能保持高效的代謝特性，從而降低了在細胞培養(yǎng)製程中為了避免乳酸堆積，而不得不將葡萄糖濃度控制在較低水準的必要，而因此減輕了培養(yǎng)中維持低水準葡萄糖對抗體產(chǎn)品糖基化的潛在負面影響。
在DG44細胞中引入丙酮酸羧化酶(hPC)基因，也可以導(dǎo)致乳酸生成的減少。此外，抗細胞凋亡基因可顯著改變CHO細胞的乳酸代謝，誘導(dǎo)向乳酸消耗的代謝轉(zhuǎn)變，並使最終抗體產(chǎn)量提高。


圖 1 外源酵母丙酮酸羧化酶2(PYC2)陽性克隆乳酸代謝改善明顯

02細胞培養(yǎng)基成分及補料策略
用於 CHO 細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基通常富含葡萄糖和穀氨醯胺，是支援細胞快速生長所必需的，與永生化細胞中底物的部分氧化的代謝特性相關(guān)。即使有足夠的氧氣供應(yīng)，葡萄糖依然通過部分氧化轉(zhuǎn)化為乳酸，而不是完全氧化為 CO2 和 H2O。

在培養(yǎng)過程中適時、適當和安全的營養(yǎng)補充策略的建立非常重要。
不同的細胞類型甚至相同來源的細胞克隆，都可能有各自不同的代謝特點及合適的補料策略 。從乳酸代謝的角度，補料策略可以著眼於代謝限制，比如限制碳源的補充；可以通過即時或線上監(jiān)測細胞代謝及營養(yǎng)物質(zhì)消耗情況指導(dǎo)補料策略。比如圖 2 和圖 3 所示的案例中，以 ActiPro 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，由於該克隆抗體特性表達率(Qp)較低，較低的Cellboost7a/7b補料量在細胞代謝和細胞生長，產(chǎn)物表達等表現(xiàn)更好。

圖 2 ActiPro作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同 Cellboost7a/7b 補料策略的細胞生長及抗體表達情況


圖 3 ActiPro作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, d3 開始每天分別補充 Cellboost7a/7b 2%/0.2% 的細胞代謝情況

03培養(yǎng)溫度控制策略
培養(yǎng)溫度是細胞培養(yǎng)最重要的製程參數(shù)之一，與其他製程參數(shù)(例如 pH 值，溶氧和二氧化碳分壓)相比，培養(yǎng)溫度更易於控制。工業(yè)生產(chǎn)中CHO細胞的饋料批次培養(yǎng)製程，很多時候會採用降溫控制策略(Temperature shift，TS)。
-- 降溫控制策略 TS
在批次培養(yǎng)的對數(shù)生長期採用 37°C 左右的生理溫度使細胞快速生長，儘快達到足夠細胞密度以生產(chǎn)抗體等產(chǎn)物。而在細胞進入對數(shù)後期及產(chǎn)物蛋白表達的平臺期，通過較低的次優(yōu)培養(yǎng)溫度，使細胞停滯於G1期降低細胞凋亡率，來延長細胞維持較高活細胞密度的培養(yǎng)時間，以獲得更多的產(chǎn)物蛋白。
乳酸代謝對培養(yǎng)溫度也很敏感，通常認為細胞培養(yǎng)過程中改變培養(yǎng)溫度，可能是乳酸由生成向消耗轉(zhuǎn)移的觸發(fā)因素之一。
但是在實際製程開發(fā)中，會發(fā)現(xiàn)隨著低溫相所採用培養(yǎng)溫度的升高，會加速乳酸的消耗。比如在降溫後溫度高於 34°C 的條件下，乳酸代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生較早，而且乳酸峰值較低，而當溫度降低至低於 33°C 時，則乳酸峰值濃度更高，代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生較晚。因此在採用降溫處理時應(yīng)兼顧乳酸代謝情況。 
此外需要注意的是，CHO 細胞培養(yǎng)中的降溫策略對關(guān)鍵品質(zhì)屬性(聚集體，電荷異構(gòu)體，N-糖基化和宿主細胞殘留蛋白)的影響，進行降溫控制時必須同時考慮產(chǎn)物表達和產(chǎn)物品質(zhì)屬性。這種溫度控制策略對細胞的生長、代謝，產(chǎn)物表達及產(chǎn)品品質(zhì)的影響具有細胞系特異性。
因而在實際製程開發(fā)中需要針對不同細胞克隆對降溫策略進行優(yōu)化，包括降溫開始時間，降溫度幅度，采用逐步降溫還是一步到位降溫方法等。

04培養(yǎng)環(huán)境的 pH
理想中的 pH 值應(yīng)在整個培養(yǎng)過程中保持恒定，不需要通過酸性或鹼性試劑進行調(diào)節(jié)。
但實際情況不可能如此，在饋料批次培養(yǎng)過程中乳酸的產(chǎn)生會導(dǎo)致 pH 下降，過低的 pH 抑制細胞的增殖，需要通過添加堿劑進行調(diào)節(jié)。
滲透壓增加通常是 pH 控制策略欠佳的結(jié)果。
依據(jù)克隆和細胞類型的不同，哺乳動物細胞培養(yǎng)中的最低 pH 極限通常在 6.6–6. 8 之間。許多生物製程都始于高 pH 值，培養(yǎng)過程中逐步降低。但是培養(yǎng)過程中 pH 值降低的速度往往不足以阻止乳酸的積累。
在適合細胞生長的範圍內(nèi)，偏高的培養(yǎng)環(huán)境 pH 通常與更快細胞的代謝速率相關(guān)，因此在細胞培養(yǎng)製程開發(fā)中，有時會通過在較低 pH 下操作，以抑制細胞增殖為代價來限制乳酸的產(chǎn)生。
而且 pH 值有時會與抗體產(chǎn)品的品質(zhì)相關(guān)，此時需要同時兼顧乳酸代謝和產(chǎn)品品質(zhì)。因此迄今為止，對於饋料批次培養(yǎng)製程中的 pH 控制方式仍然沒有固定的策略。


圖 4 饋料批次培養(yǎng)中環(huán)境 pH 對乳酸代謝的影響情況

05 CO₂分壓
與小規(guī)模培養(yǎng)相比，乳酸的產(chǎn)生通常會隨著培養(yǎng)規(guī)模的擴大而增加，大規(guī)模培養(yǎng)時乳酸消耗的代謝轉(zhuǎn)變減少或完全不發(fā)生。引起這種現(xiàn)象的原因可能與不同規(guī)模生物反應(yīng)器的氣體交換特點相關(guān)，比如小體積反應(yīng)器的 CO2 排出效率遠遠高於大體積反應(yīng)器，目前已發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)製程中的 pCO2 可能會影響乳酸的產(chǎn)生。

有研究發(fā)現(xiàn)，在饋料批次培養(yǎng)過程中 pCO2 控制在 12.5％ 時，乳酸可以在培養(yǎng)中由生成轉(zhuǎn)變?yōu)橄?；而?pCO2 升高為 20％ 時，整個饋料批次培養(yǎng)過程中都有乳酸生成。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生前後 CO2 分壓對細胞代謝的影響是不同的。代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生前，pCO2 升高時細胞的單位氧消耗率下降，表明此條件下細胞的氧化能力較弱，因此引起乳酸持續(xù)生成。而代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生後，不同 pCO2 條件下細胞的平均耗氧量和細胞生長的平均速率相似。但是較低 pCO2 條件下，葡萄糖消耗量更低，細胞更傾向於消耗乳酸和氨。

目前認為乳酸代謝轉(zhuǎn)移前細胞的代謝差異，是引起饋料批次培養(yǎng)過程中乳酸代謝差異的主要原因，而代謝轉(zhuǎn)移發(fā)生後的細胞代謝差異在某種程度上可能是乳酸代謝差異的結(jié)果。不同pCO₂條件下，pH值曲線差異輕微但滲透壓濃度卻可能差異巨大。較高pCO₂條件下的滲透壓往往更高，進一步影響細胞代謝。
對於 pCO₂ 對細胞乳酸代謝影響的機制還無法確切解釋，目前認為可能與 CO₂/HCO₃- 參與酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)。在饋料批次培養(yǎng)中通過降低的CO₂/HCO₃- 濃度，可促進乳酸向消耗代謝方向轉(zhuǎn)變，對於緩解或解決大規(guī)模饋料批次培養(yǎng)或灌流培養(yǎng)時的乳酸堆積具有重要意義。


圖 5 饋料批次培養(yǎng)中不同 pCO₂ 條件下的乳酸代謝情況


圖 6 饋料批次培養(yǎng)中不同 pCO₂ 條件下的滲透壓變化情況
 
本文簡要介紹了CHO細胞作為宿主表達重組蛋白和單抗的饋料批次培養(yǎng)中乳酸代謝，及其代謝轉(zhuǎn)移的影響及控制因素，以在饋料批次培養(yǎng)製程的建立中提供細胞代謝層面的理論依據(jù)。